scRNA-seq及DAP-seq技术联合应用揭示了比克氏棉色素腺体的发育轨迹和转录调控网络；2023年DAP-seq技术助力发表Molecular Plant文章

色素腺体是棉属及其近缘植物所特有的防御结构，其内含物棉酚能够提高棉花对病虫害的抗性。但是，由于色素腺及棉籽酚的存在，限制了棉籽的综合利用。理想的棉花是种子无腺体和植株有腺体，这一特性只在澳大利亚的野生棉花中发现，例如：比克氏棉。目前，将该性状引入到栽培植物中仍然存在困难。因此，了解色素腺形态发生的生物学过程及其相关的分子机制，将有助于培育具有无腺体种子和有腺体植株性状的栽培棉花新品种。
2023年2月9日，浙江大学农业与生物技术学院的最新研究成果，发表在Molecular Plant期刊上(影响因子21.949)，文章题目为“Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in Gossypium bickii”。该研究使用DNA亲和纯化测序(DAP-seq)技术鉴定了比克氏棉子叶GoPGF的结合基序和下游靶基因。并进一步揭示了比克氏棉色素腺形态建成的调控网络，为培育具有特定性状的栽培棉花新品种提供了宝贵的基因资源。

从萌发的比克氏棉子叶中分离原生质体，进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），保留了12222个单细胞转录组数据用于下游分析。聚类为14个不同的细胞簇，这些细胞在已知的细胞标记基因的辅助下被分为8个细胞类群，包括：叶肉细胞(MC)、色素腺细胞(PG)、表皮细胞(EC)、保卫细胞(GC)、木质部细胞(XC)、原形成层细胞(PC)、韧皮部薄壁细胞(PP)和伴胞(CC)。色素腺细胞群与其他细胞群的分离效果良好，并进一步分为色素腺薄壁细胞、分泌细胞和凋亡细胞。随后，通过分析3种色素腺细胞的连续分化轨迹，初步阐明了色素腺的发育模式。

图1. 棉花子叶单细胞转录图谱的构建

转录因子是植物所有生物过程的关键调控因子，包括色素腺的形成。在色素腺细胞中鉴定的转录因子，大多数与色素腺薄壁细胞的分化有关，包括bHLH、AP2/ERF、C2H2、GRAS、NAC和WRKY。从薄壁细胞向分泌细胞的转变受AP2/ERFs和WRKYs的调控，而从分泌细胞向凋亡细胞的转变受MYBs的调控。GoPGF是一种bHLH转录因子，已被证明在色素腺薄壁细胞起始中发挥重要作用，但调控色素腺形态发生的转录调控网络仍不清楚。采用DAP-seq分析对GoPGF下游靶基因进行鉴定，并通过整合DAP-seq和scRNA-seq的结果，构建了一个以GoPGF为hub基因的转录调控网络。

图2. 调节色素腺细胞发育的转录因子网络

接下来，利用病毒介导的基因沉默系统对8个与色素腺形成相关的转录因子进行基因沉默，其中包括3个新基因GbiERF114（AP2/ERF），GbiZAT11（C2H2）和GbiNTL9（NAC），以及5个已知的同源基因GbiCGF1(bHLH)，GbiGoPGF(bHLH)，GbiGoSPGF(GRAS)，GbiCGP1(MYB)和GbiCGF2(NAC)，这些基因的沉默显著影响幼苗叶片和茎中色素腺的发育及其棉酚含量。因此，这些类型的转录因子可能在棉花色素腺的形成中起重要作用。通过功能富集分析、顺式调节元件分析，还发现光和赤霉素可以促进色素腺的形成。

图3. 转录因子在色素腺发育中的功能验证

小结：该研究整合了色素腺细胞的发育轨迹、转录因子调控网络和核心转录因子的功能验证，提出了一个相对完整的色素腺形态建成模型。同时，解析了GoPGF和其他转录因子在色素腺形成中的作用机制。此外，还发现了3个与色素腺体形成相关的功能基因（GbiERF114、GbiZAT11、GbiNTL9）以及光和赤霉素促进色素腺形成这一现象。这些发现为棉花色素腺的形态建成提供了新的见解，为栽培棉花新品种培育提供了珍贵的基因资源。